ANALISANDO - Nº 15 - Ano 4 - Fev/Abr 2015
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Autores: Augusto C. P. de Jesus1; Graziele L. N. Lima1; Ana Carolina C. Menezes1; Cristiane A.S. Menezes2
1Acadêmicos do curso de Biomedicina da Universidade Federal de Minas Gerais, 2 Professora da Disciplina de Imunologia Clínica da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais
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INTRODUÇÃO
O Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o agente causador da Doença de Chagas ou tripanossomíase americana, uma doença endêmica nas Américas Central e do Sul e que foi descoberta pelo cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909. Este pesquisador descreveu a doença, o agente etiológico, os insetos transmissores além dos reservatórios domésticos e silvestres. O ciclo de transmissão da doença de Chagas está representado na figura 1.
A infecção pelo T. cruzi pode se dar por via vetorial, via oral, transfusional, através de transplante de órgãos, transmissão congênita ou acidental. Após a infecção pelo T. cruzi, o indivíduo entra em uma fase aguda, caracterizada pela presença de parasitos no sangue periférico, podendo apresentar ou não sintomas como febre, fraqueza e algum chagoma de inoculação. Após um período que pode variar de 2-4 meses, através da ação do sistema imune, a parasitemia é controlada e o indivíduo infectado entrará na fase crônica da doença de Chagas. A fase crônica pode ser assintomática (forma indeterminada) ou sintomática, acometendo órgãos do sistema cardiovascular e/ou digestórios (formas cardíaca, digestiva ou cardiodigestiva).
A forma de diagnóstico durante a fase aguda é a detecção de parasitos circulantes em exames parasitológicos diretos de sangue periférico (exame a fresco, esfregaço, gota espessa) e a presença de anticorpos IgM anti-T. cruzi no sangue. Na fase crônica, o diagnóstico é feito pela detecção de anticorpos IgG anti-T. cruzi por três testes sorológicos de princípios distintos, sendo a Imunofluorescência Indireta (IFI), a Hemaglutinação (HE) e o ELISA os métodos recomendados.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a doença de Chagas acomete aproximadamente 10 milhões de pessoas e cerca de 120 milhões estão sob o risco de infecção. Para confirmar a suspeita clínica da doença e triagem nos bancos de sangue, testes sorológicos são utilizados. Os métodos de hemaglutinação e imunoensaio enzimático são bastante utilizados para o diagnóstico da doença de Chagas e serão descritos a seguir.
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA
As hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação. Na hemaglutinação indireta (HAI) elas são suportes para antígenos que são adsorvidos à sua superfície, que para doença de Chagas são antígenos de Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença. São usadas hemácias de aves que podem ser fixadas em formaldeído ou glutaraldeído o que soluciona o problema da fragilidade e da estocagem por longos períodos de tempo. Uma vez na presença de glutaraldeído, após tratamento com ácido tânico, essas hemácias expõem cargas residuais e adsorvem as proteínas e glicoproteínas com elevada estabilidade, aumentando a quantidade de proteína adsorvida e tornando maior a sensibilidade do sistema. Empregando antígenos purificados obtém-se maior sensibilidade e especificidade.
É utilizada uma placa de microtitulação com fundo em V, onde se adiciona a amostra, que se for reagente conterá anticorpos anti-T. cruzi. Adiciona-se também os controles positivo e negativo e as hemácias sensibilizadas com antígeno aos poços onde foram adicionados os três itens anteriores separadamente.
A positividade do teste pode ser visualizada a olho nu e os critérios de determinação da reatividade são:
Amostra reagente: hemácias distribuídas de maneira homogênea, em forma de tapete ou manto, formado pela malha de imunocomplexos Antígeno-Anticorpo, ocupando área maior do que 50% do fundo da placa.
Amostra não reagente: hemácias acumuladas em formas de botão no fundo do poço.
Amostra indeterminada: qualquer padrão diferente dos anteriores. Esses três critérios estão demonstrados na figura 3.
O teste pode ser semi-quantitativo, titulando a presença de anticorpos utilizando diluições seriadas com o diluente. A placa e todos os reagentes necessários estão presentes no kit CHAGAS - HAI - CAT. 510, comercializado pela Gold Analisa.
ELISA
O teste de ELISA (Enzyme-likedImmunosorbentAssay) é amplamente utilizado para realizar o diagnóstico da Doença de Chagas, pois apresenta elevada sensibilidade, especificidade, rapidez e baixo custo. Existem dois tipos de teste de ELISA: o indireto e o sanduíche, sendo que para diagnosticar a doença de Chagas é realizado o teste indireto (Figura 4). Esta técnica consiste em detectar anticorpos contra o parasito, Trypanosoma cruzi, através da utilização de um segundo anticorpo (anti-imunoglobulina humana produzido em animais de laboratório) conjugados a enzimas, que em presença de substratos específicos geram produtos coloridos, cuja quantificação é feita espectrofotometricamente. A reação pode ser avaliada como reagente, não reagente ou indeterminada a partir da absorbância (ou densidade óptica) obtida pelo espectrofotômetro em comparação ao cut-off (ponto de corte). Amostras com valores acima do cut-off são consideradas positivas, abaixo negativas e amostras com valores em torno do cut-off, chamada de zona cinza (borderline), são consideradas indeterminadas e não se pode ter certeza do resultado.
Este teste pode ser utilizado em larga escala devido à sua possibilidade de automatização como, por exemplo, o uso do sistema VIDAS e o IMX. Sendo assim, o teste apresenta maior reprodutibilidade, com menor chance de erros.
CONCLUSÃO
Este estudo aponta dois tipos de técnicas utilizadas para diagnóstico da doença de Chagas, são elas: HEMAGLUTINAÇÃO e ELISA. Esses métodos possuem alta sensibilidade e especificidade na pesquisa de anticorpos específicos, se com-parado com outros testes que também são utilizados para o diagnóstico dessa doença, como IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Almeida, Bethânia Ribeiro de;Santiliano, Fabiano Costa. Levantamento dos métodos de diagnóstico para a doença de Chagas. Editora Biosfera (2012).
- Bertho, Álvaro Luiz; Citometria de fluxo. FIOCRUZ, Rio de Janeiro.
- Doença de Chagas – Triagem e diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e laboratórios de saúde pública. – Brasília: Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids. 76. p. : I1 (1998).
- Rocha, M.O., Ribeiro, A.L., Teixeira, M.M. An update on the management of Chagas cardiomyopathy. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 5(4), 727–743 (2007).
- Vaz, Adelaide J. Imunoensaios Fundamentos e Aplicações. Editora Eletrônica.
- World Health Organization. Control of Chagas disease. Tech. Rep. Ser. 905 i109. (2002).
http://www.uft.edu.br/parasitologia/pt_BR/exames/ rea%C3%A7%C3%B5es_de_aglutina%C3%A7%C3%A3o/rea%C3%A7%C3%A3o+de+hemaglutina%C3%A7%C3%A3o/index.html